Unukuzi wa nakala za Coronavirus: NMPylation muhimu na ya kuchagua ya vitengo vidogo vya NiRAN-RdRp kwa tovuti zilizohifadhiwa katika nsp9

Iliyohaririwa na Peter Sarnow, Shule ya Tiba ya Chuo Kikuu cha Stanford, Chuo Kikuu cha Stanford, California, iliidhinishwa mnamo Desemba 25, 2020 (iliyokaguliwa mnamo Oktoba 25, 2020)

Tunaripoti mwingiliano kati ya vitengo vidogo katika uigaji wa nakala za maandishi ya coronaviruses, ambayo ni muhimu kwa urudufishaji na uhifadhi wa mageuzi.Tulitoa ushahidi kwamba kikoa cha NiRAN kinachohusishwa na nsp12 kina shughuli ya uhawilishaji ya nucleoside monofosfati (NMP) katika trans, na kubainisha nsp9 (protini inayofunga RNA) kama lengo lake.NiRAN huchochea kiambatisho shirikishi cha kikundi cha NMP kwa kituo cha amino cha nsp9 kilichohifadhiwa katika athari ambayo inategemea ioni za Mn2+ na masalia ya Asn yaliyohifadhiwa karibu.Ilibainika kuwa shughuli za NiRAN na NMPylation ya nsp9 ni muhimu kwa ujirudiaji wa coronavirus.Data huturuhusu kuunganisha shughuli hii ya kiashiria cha kimeng'enya cha virusi vilivyowekwa kwenye uchunguzi wa awali katika dhana kwamba uanzishaji wa usanisi wa RNA katika darasa la virusi vya RNA ni wa kiutendaji na unalingana kimageuzi.

RNA polymerase (RdRps) inayotegemea RNA ya Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, na familia nyingine 12) imeunganishwa na kikoa cha amino-terminal (N-terminal) katika protini isiyo ya kimuundo (nsp) iliyotolewa kutoka kwa polyprotein, iitwayo NiRAN. 1ab inaundwa na virusi kuu ya protease (Mpro).Hapo awali, shughuli ya GMPylation/UMPylation ya virusi vya ateri ya NiRAN-RdRp nsp iliripotiwa, na ilipendekezwa kuzalisha muda mfupi kwa ajili ya kuhamisha nucleoside monofosfati (NMP) hadi kwa virusi (havijulikani kwa sasa) na/au vitu vya biopolymerization ya seli.Hapa, tunaonyesha kwamba virusi vya Korona (Human Coronavirus [HCoV]-229E na Severe Acute Respiratory Syndrome 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ina shughuli ya NMPylation inayotegemea Mn2+, ambayo inatokana na nsp9 kupitia uundaji wa Mpro-mediated nsp9 After N-terminal flanking nsps hutolewa kwa proteolytically, phosphoramidate inaunganishwa na amini ya msingi (N3825) kwenye N-terminal ya nsp9.Uridine trifosfati ndiyo nyukleotidi inayopendelewa katika mmenyuko huu, lakini adenosine trifosfati, guanosine trifosfati, na cytidine trifosfati pia ni substrates ushirikiano zinazofaa.Uchunguzi wa mabadiliko kwa kutumia protini za nsp9 na nsp12 zinazoweza kuunganishwa tena na vibadilishaji vinasaba vya HCoV-229E vilibainisha mabaki yanayohitajika kwa NMPylation ya NSP9 iliyopatanishwa na NiRAN na uigaji wa virusi katika utamaduni wa seli.Data ilithibitisha ubashiri wa mabaki ya tovuti hai ya NiRAN na kuamua jukumu muhimu la mabaki ya nsp9 N3826 katika NMPylation ya nsp9 na uigaji wa virusi katika vitro.Masalio haya ni sehemu ya mfuatano wa N-terminal NNE tripeptide iliyohifadhiwa na imethibitishwa kuwa mabaki ya pekee yasiyobadilika ya nsp9 na homologi zake katika familia ya coronavirus.Utafiti huu unatoa msingi dhabiti wa uchunguzi wa utendaji kazi wa shughuli ya NMPylation ya virusi vingine vilivyowekwa kwenye kiota na unapendekeza shabaha zinazowezekana za ukuzaji wa dawa za kuzuia virusi.

Virusi vya Nidovirales chanya-stranded RNA huambukiza aina mbalimbali za wanyama wenye uti wa mgongo na wasio na uti wa mgongo (1, 2).Agizo hilo kwa sasa linajumuisha familia 14 (3), ambazo familia ya Coronavirus imefanyiwa uchunguzi wa kina katika miaka 20 iliyopita.Wakati huo, coronaviruses tatu za zoonotic ziliibuka kutoka kwa wanyama na kusababisha milipuko mikubwa ya maambukizo makali ya kupumua kwa wanadamu.Ikiwa ni pamoja na magonjwa ya milipuko yanayosababishwa na magonjwa makali ya kuambukiza.Ugonjwa wa Kupumua Virusi vya Korona 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Virusi vya Nidovirus hushiriki shirika la kawaida la jenomu, na kitengo kidogo cha changamano cha unukuzi-kilimo cha utando (RTC) kimesimbwa katika theluthi mbili ya 5-?²-terminal na sehemu kuu ya miundo ya chembe ya virusi, pamoja na baadhi ya vifaa. .Protini, iliyosimbwa katika 3??² mwisho wa theluthi ya jenomu (1).Isipokuwa kwa familia moja ya virusi vya planarian (Monoviridae) (8), virusi vyote vilivyowekwa kiota husimba vitengo vidogo vya RTC katika fremu mbili kubwa za usomaji wazi (ORF) ORF1a na ORF1b, ambazo zimetafsiriwa kutoka genomic RNA ya.ORF1a husimba polyprotein (pp) 1a, na ORF1a na ORF1b husimba pp1ab kwa pamoja.Kwa ushiriki wa jumla wa protease kuu (Mpro) iliyosimbwa na ORF1a, pp1a na pp1ab zote mbili huchakatwa kwa njia ya kiprotini kuwa aina mbalimbali za protini zisizo za kimuundo (nsps), pia hujulikana kama 3CLpro, kwa sababu ina homolojia na 3Cpro ya picornavirus ( 9).NPS hizi zinadhaniwa kukusanywa katika RTC kubwa inayobadilika, huchochea usanisi wa RNA ya jenomu (replication) na seti ya subgenomic RNA (manukuu), na hutumiwa kuratibu usemi wa ORF iliyoko chini ya mkondo wa ORF1b (10? ? ?12).

RTC kuu ni pamoja na RNA polymerase (RdRp) (RdRp) inayotegemea RNA (13), helikosi 1 ya familia kubwa (HEL1) (14, 15) na vimeng'enya kadhaa vya usindikaji vya RNA, ambavyo vimesimbwa hasa katika ORF1b na katika familia ya coronavirus Ina nsp12-nsp16 na nsp9-nsp12 katika familia ya Arterioviridae (tazama rejeleo 10ââ 12).RdRp na HEL1 zinawakilisha sehemu mbili (moja ya tano) zilizohifadhiwa za virusi vya kiota cha ndege na zina homolojia kati ya virusi vingine vya RNA.Replicase ya msingi inaaminika kusaidiwa na vitengo vingine, ikijumuisha nsps kadhaa ndogo iliyotolewa kutoka eneo la carboxy-terminal (C-terminal) ya pp1a, chini ya mkondo wa Mpro (coronavirus nsp5 na ateri virus nsp4, mtawalia).Wana ulinzi maalum wa kifamilia na shughuli mbalimbali (zilizopitiwa katika rejeleo 10ââ12).

Hivi majuzi, kikoa kilicho na sifa za mfuatano wa kipekee kilipatikana kwenye kituo cha amino (N-terminus) kilicho karibu na RdRp katika virusi vyote vilivyowekwa kiota, lakini hakuna virusi vingine vya RNA (16).Kulingana na eneo lake na shughuli ya kuhamisha nyukleotidi (nucleoside monophosphate [NMP] transferase) kikoa hiki kinaitwa NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Mchanganyiko wa vikoa viwili vya NiRAN-RdRp hujumuisha nsp12 katika familia ya Coronaviridae na nsp9 katika familia ya Arterioviridae, na katika nestoviridae nyingine, NiRAN-RdRp inatarajiwa kutolewa kama nsp huru kutoka kwa poliproteini ya virusi.Katika coronavirus, kikoa cha NiRAN kina ??1/450 mabaki na imeunganishwa kwenye kikoa cha C-terminal RdRp kupitia eneo la kiunganishi (16?19).Katika Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), recombinant nsp9 inaonyesha shughuli za UMPylation na GMPylation zinazotegemea ioni za Mn2+, ambazo zinategemea besi tatu za mfuatano zilizohifadhiwa katika nestovirus, AN, BN na CN Mabaki katika mlolongo.Ambapo N inasimama kwa NiRAN) (16).Ubavu wa N-terminal wa motifu hizi ni motifu isiyo ya kihafidhina preAN.Baadhi ya mabaki haya pia huhifadhiwa katika kinasi ya protini inayohusiana kwa mbali, ambapo imeonyeshwa kuhusika katika ufungaji wa nucleoside trifosfati (NTP) na shughuli za kichocheo (20, 21).Sambamba na uchunguzi huu, mabaki kadhaa muhimu ya tovuti amilifu katika pseudokinase SelO kutoka Pseudomonas syringae yanaweza kuunganishwa na toleo kuu la SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 lililochapishwa hivi majuzi.Mabaki ya Virusi vya Korona Vilivyohifadhiwa vya NiRAN vilivyowekwa juu zaidi katika muundo mdogo wa elektroni.Recombinant protini (17).Inakisiwa kuwa kumbukumbu (binafsi) U/GMPylation itatoa hali ya muda mfupi ya kuhamisha NMP hadi (haijulikani kwa sasa) substrate (16), na mfanano wa kimuundo kati ya NiRAN na protini kinase (17, 19) ) Je! NiRAN hurekebisha protini zingine.

Vipengele vingi, ikiwa ni pamoja na ushirikiano wake wa kipekee na wa kipekee wa kimfumo na virusi vilivyowekwa kwenye kiota na utengano wa kijeni kutoka kwa RdRp, hufanya NiRAN kuwa kimeng'enya muhimu cha udhibiti kwa virusi vilivyoota, ambayo ni muhimu kwa kuibuka na utambulisho wao.Hapo awali, vipengele vitatu vinavyowezekana vinavyohusisha NiRAN ili kudhibiti tafsiri ya jenomu/subgenomic au urudufishaji/unukuzi ziliitwa.Wakati wa kuzingatia data adimu na pungufu inayopatikana wakati huo, kila kazi ina faida na hasara zake (16).Katika utafiti huu, tunalenga kuchanganya uchunguzi wa kibiokemikali na kubadili maumbile ya virusi vya corona vinavyowakilisha aina hizi mbili, na kuweka matokeo yetu katika usuli wa mabadiliko ya asili ya familia ya coronavirus, ili kupata maarifa kuhusu ulimwengu huu wa Ajabu.Tunaripoti maendeleo makubwa katika uelewaji wa NiRAN kupitia utambuzi wa shabaha asilia katika RTC, ambayo (kati ya dhahania tatu zinazopatikana) huchangia jukumu la kikoa hiki katika kuanzisha usanisi wa virusi vya RNA.Utafiti huu pia unafungua uwezekano wa majukumu mengine ya NiRAN kwenye kiolesura cha mwenyeji wa virusi.

Ili kubainisha sifa za enzymatic ya virusi vya corona vinavyohusiana na kikoa cha NiRAN cha nsp12, tulitoa aina ya mchanganyiko wa virusi vya corona 229E (HCoV-229E) nsp12 katika E. coli, ikiwa na lebo ya His6 kwenye C-terminus, na kuchanganya protini yenye [α32-P ] Ingiza pamoja na NTP mbele ya MnCl2 kama ilivyoelezwa katika Nyenzo na Mbinu.Uchanganuzi wa bidhaa ya mmenyuko ulionyesha uwepo wa protini yenye alama ya mionzi inayohamia pamoja na nsp12 (106 kDa), ikionyesha kuwa coronavirus nsp12 huchochea uundaji wa viambatanisho vya protini-NMP, iliyoundwa kwa upendeleo na uridine monophosphate (UMP) (Mchoro 1A) Na. B).Uchambuzi wa kiasi ulionyesha kuwa ikilinganishwa na nucleotides nyingine, ukubwa wa ishara ya kuingizwa kwa UMP iliongezeka kwa mara 2 hadi 3 (Kielelezo 1C).Data hii inalingana na shughuli iliyotabiriwa ya uhamishaji wa NMP ya kikoa cha NiRAN cha coronavirus (16), lakini inaonyesha kuwa mapendeleo ya nyukleotidi ya kikoa cha NiRAN cha coronavirus na virusi vya ateri ni tofauti.

Shughuli ya kujilinda ya HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) iliwekwa kwenye [α-32P] NTP iliyoteuliwa mbele ya 6 mM MnCl2 kwa dakika 30 (angalia Nyenzo na Mbinu kwa maelezo zaidi).Bidhaa za athari zilitenganishwa na SDS-PAGE na kupakwa rangi ya samawati ya Coomassie.(B) Protini iliyo na alama ya radio inaonyeshwa kwa taswira ya fosforasi.Nafasi za nsp12-His6 na alama za molekuli za protini za molekuli (katika kilodaltons) zinaonyeshwa katika A na B. (C) Uzito wa ishara ya mionzi (maana ± SEM) iliamuliwa kutoka kwa majaribio matatu ya kujitegemea.*P≤0.05.Nguvu ya ishara (asilimia) inahusiana na UTP.

Ingawa shughuli za kimeng'enya zinazohusiana na NiRAN zimeonyeshwa kuwa muhimu kwa urudufishaji wa EAV na SARS-CoV katika utamaduni wa seli (16), utendakazi mahususi wa NiRAN na malengo yanayowezekana bado hayajabainishwa.Ulinganifu wa kimuundo ulioripotiwa hivi majuzi kati ya NiRAN na familia ya protini zilizo na mikunjo ya protini kinase (17, 22) ilitusukuma kujaribu dhana kwamba NiRAN huchochea NMPylation ya protini zingine.Tumeunda seti ya malengo yanayoweza kuwa sawa, ikijumuisha protini zisizo za muundo zilizosimbwa na HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), kila moja ikiwa na lebo ya C-terminal His6 ( kiambatanisho cha SI, Jedwali S1) , Na kuanika protini hizi kwa [α32-P] uridine trifosfati ([α32-P]UTP) kukiwa na nsp12.Albumini ya seramu ya ng'ombe na protini ya mchanganyiko wa MBP-LacZα inayozalishwa katika E. koli ilitumika kama vidhibiti (Mchoro 2A, njia ya 1 hadi 7).Protini iliyo na alama ya redio ilichambuliwa na electrophoresis ya gel ya sodiamu ya dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) na autoradiography, na ilibainika kuwa kulikuwa na ishara kali ya mionzi katika majibu yenye nsp12 na nsp9.Msimamo wa ishara inalingana na molekuli ya molekuli ya nsp9, inayoonyesha UMPylation ya nsp12-mediated ya nsp9 (Mchoro 2B, wimbo wa 7).Hakuna protini nyingine za majaribio zilizopatikana kuwa UMPylated, ambayo ilitufanya tuhitimishe kuwa nsp9 ni sehemu ndogo ya nsp12.Kwa mujibu wa data ya NMPylation binafsi iliyoonyeshwa kwenye Mchoro 1, nsp12 ina uwezo wa kuhamisha NMP zote nne hadi nsp9, ingawa ufanisi ni tofauti, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Picha).3 A na B).Chini ya masharti yaliyotumiwa katika uchanganuzi huu (fupisha athari na wakati wa mfiduo, punguza mkusanyiko wa nsp12; nyenzo na mbinu), NMPylation ya kibinafsi ya nsp12 haikuweza kugunduliwa (linganisha Mchoro 2B, mstari wa 7, na Mchoro 1B), ambayo. ilionyesha ufanisi (Na raundi nyingi) UMP ilisogezwa kutoka nsp12 hadi nsp9.Shughuli ya uhamishaji wa UMP inahitaji uwepo wa ioni za Mn2+, kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 3C, wakati shughuli ndogo tu ya uhamishaji wa UMP ilizingatiwa katika uwepo wa Mg2+, na hakuna shughuli yoyote mbele ya migawanyiko mingine miwili iliyojaribiwa.Data sawia ilipatikana katika majaribio ya NMPylation yenye cytidine trifosfati (CTP), guanosine trifosfati (GTP), na adenosine trifosfati (ATP) (SI kiambatisho, Kielelezo S1).

HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation ya nsp9.Msururu wa substrates za protini (ikiwa ni pamoja na albumin ya seramu ya ng'ombe, MBP-lacZα, na msururu wa HCoV-229E nsps wenye lebo ya C-terminal His6 iliyosimbwa na ORF1a) ilitumika kutathmini shughuli ya UMPylation ya HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated. protini.Ingiza protini kwa [α-32P] UTP kwa dakika 10 bila (A) au uwepo (B) wa nsp12 kama ilivyoelezwa katika nyenzo na mbinu.Juu ya A na B, jeli ya SDS-polyacrylamide iliyotiwa rangi ya Coomassie Brilliant Blue inaonyeshwa, na chini ya A na B, michoro sambamba zinaonyeshwa.Msimamo wa alama ya molekuli ya molekuli ya protini (katika kilodaltons) hutolewa upande wa kushoto.Msimamo wa nsp12-His6 (B, juu) na ishara ya mionzi iliyozingatiwa wakati wa incubation ya nsp12-His6 na nsp9-His6 (B, mstari wa 7) pia imeonyeshwa, ambayo inaonyesha kuwa [α-32P]UMP hadi nsp9-His6. (12.9 kDa), ambayo haikuzingatiwa kwa protini zingine zilizojaribiwa.

HCoV-229E NiRAN-mediated biokemikali na virological sifa ya nsp9 NMPylation.(A na B) Jukumu la substrate ya nyukleotidi inayotumika katika mmenyuko.Nsp12-His6 na nsp9-His6 zimechanganywa na kuwekewa incubated mbele ya [α-32P] NTP tofauti katika kipimo cha kawaida cha NMPylation.(A, juu) Nsp9-His6 yenye rangi ya Coomassie ikitenganishwa na SDS-PAGE.(A, chini) Autoradiograph ya eneo moja la gel.(B) Shughuli ya jamaa (inamaanisha ± SEM) mbele ya kofakta ya nyukleotidi iliyoteuliwa imedhamiriwa kutoka kwa majaribio matatu huru.*P≤0.05.(C) Jukumu la ioni za chuma.Kinachoonyeshwa ni kipimo cha kawaida cha NMPylation ikiwa kuna [α-32P] UTP na ayoni tofauti za chuma, kila moja ikiwa na mkusanyiko wa mm 1.Katika C, juu, Coomassie iliyochafuliwa nsp9-His6 imeonyeshwa, na katika C, chini, autoradiography inayofanana inaonyeshwa.Ukubwa wa protini iliyo na lebo (katika kilodaltons) unaonyeshwa upande wa kushoto wa A na C. (D) Aina ya kubadilika ya HCoV-229E nsp12-His6 iliyobeba kibadala cha amino asidi iliyobainishwa iko katika [α-32P]UTP, kama ilivyoelezwa. katika Nyenzo na Mbinu.Nsp9-His6 iliyo na alama ya redio inayozalishwa katika mmenyuko wa NMPylation hugunduliwa na picha ya phosphorylation (D, juu).Shughuli ya jamaa ikilinganishwa na protini ya aina ya mwitu (wt) inaonyeshwa katika D, na ya chini inachukuliwa kama wastani (±SEM) kutoka kwa majaribio matatu ya Kujitegemea.Nyota zinaonyesha uingizwaji wa mabaki yasiyohifadhiwa.(E) Kiini cha virusi katika tamaduni bora zaidi ya seli za p1 zilizopatikana saa 24 baada ya kuambukizwa kuamuliwa na uchunguzi wa plaque.Ubadilishaji wa kodoni katika kikoa cha NiRAN cha kibadilishaji cha HCoV-229E kilichobuniwa huonyeshwa (nambari za masalio zinatokana na nafasi yao katika pp1ab).RdRp tovuti inayotumika inayobadilika yenye upungufu wa kurudia nsp12_DD4823/4AA ilitumika kama kidhibiti.

Ili kupata ufahamu wa kina wa tovuti inayotumika ya NiRAN na kuamua mabaki yanayohusiana na shughuli ya uhamishaji wa NMP9-maalum, tulifanya uchanganuzi wa mabadiliko, ambapo tulibadilisha mabaki ya kihafidhina katika motifs za NiRAN AN, BN na CN ( 16) Ni Ala (kiambatisho cha SI, Kielelezo S2).Kwa kuongezea, athari za vibadala vya kihafidhina vya Arg-to-Ls au Lys-to-Arg vilitathminiwa katika visa viwili.Kama udhibiti (hasi), mabaki ambayo hayajahifadhiwa au hayajahifadhiwa katika kikoa cha NiRAN cha coronaviruses na virusi vingine vilivyowekwa kwenye viota hubadilishwa na Ala. Inabadilisha K4116A (katika motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif BN) na D4280A (CN) hupunguza kwa kiasi kikubwa au hata kuondoa nsp9 NMPylation kupitia nsp12, wakati protini zilizo na mbadala za kihafidhina (R4178K) , K4116R) huhifadhi 60% na 80% ya shughuli zao, ambayo inaonyesha kuwa kupumzika kwa vikwazo kwa upande wao. minyororo ni nyeti ya physicochemically (Kielelezo 3D).Kubadilisha mabaki mengine kadhaa yaliyohifadhiwa E4145A, D4273A, F4281A na D4283A haina madhara kidogo, na nsp9 UMPylation imepunguzwa tu kwa kiasi.Matokeo sawa yalipatikana katika miitikio ya nsp9 ya NMPylation inayohusisha NTP nyingine (Kielelezo 3D na kiambatisho cha SI, Kielelezo S3), kuthibitisha kwamba athari zilizozingatiwa kwenye vibadala maalum vya amino asidi hazitegemei aina ya substrate ya nyukleotidi inayotumiwa.Kisha, tulijaribu athari inayowezekana ya vibadala hivi vya nsp12 kwenye urudiaji wa virusi vya corona katika utamaduni wa seli.Kufikia hili, tulitumia violezo vinavyofaa vya DNA (cDNA) vilivyoundwa kijenetiki vilivyoundwa katika virusi vya chanjo ya recombinant (23, 24) ili kunakili seli 5 -7.Titration ya vizazi vya virusi vya kuambukiza vinavyozalishwa katika seli hizi ilionyesha kuwa mutants nyingi za HCoV-229E NiRAN hazikuwezekana (Mchoro 3E).Kundi la vibadilisho vya virusi visivyoweza kuepukika ni pamoja na vibadala ambavyo vimeonyeshwa kuondoa au kupunguza kwa kiasi kikubwa shughuli ya uhamishaji wa NMP katika vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), lakini kuna njia zingine mbili (K4116R, E4105A) % zimehifadhiwa?Shughuli yao ya in vitro NMPylation inapendekeza kuwa vizuizi vya ziada vinahusika.Vile vile, mabadiliko mengine mawili (R4178K, F4281A) ambayo yalisababisha kupungua kwa wastani kwa shughuli ya NMPylation ya NiRAN ilizalisha virusi hai, hata hivyo, virusi hivi vilipunguza titer kwa kiasi kikubwa kupitia replication.Sambamba na data ya shughuli za in vitro iliyoonyeshwa kwenye Mchoro 3D, ikichukua nafasi ya masalia mengine manne ambayo hayajahifadhiwa katika virusi vya corona na/au virusi vingine vilivyowekwa kwenye viota (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) vilitoa virusi vinavyoweza kufaa Watoto, licha ya kuwa na titer iliyopunguzwa kwa wastani ikilinganishwa na virusi vya aina ya mwitu (Mchoro 3E).

Ili kusoma ikiwa shughuli ya uhawilishaji ya NMP inayopatanishwa na NiRAN inategemea kikoa amilifu cha RdRp, mabaki mawili ya Asp yaliyohifadhiwa yanayohusika katika uratibu wa ioni za metali divalent (11) katika RdRp motif C yalibadilishwa na Ala. Protini inayotokana nsp12_DD4823/4AA hubakia. shughuli yake ya NMPylation ya nsp9, ikionyesha kuwa shughuli ya nsp12-iliyopatanishwa katika vitro nsp9 NMPylation haihitaji shughuli ya polimerasi (Kiambatisho cha SI, Kielelezo S4).

Baada ya kuanzisha shughuli mahususi ya NMP ya nsp9 kwa nsp12, tulijaribu kubainisha kiambatisho cha NMP-nsp9 kwa spectrometry ya wingi (MS).Wigo kamili wa molekuli ya protini ya recombinant HCoV-229E nsp9 ilionyesha kilele cha Da 12,045 (Mchoro 4A).Ongezeko la nsp12 halikubadilisha ubora wa nsp9, ikionyesha kwamba nsp12 na nsp9 hazitaunda tata thabiti chini ya masharti yaliyotumiwa (denaturation) (Mchoro 4A).Mbele ya UTP na GTP, kipimo cha wingi cha athari iliyo na nsp9 na nsp12 mtawaliwa ilionyesha kuwa protini ya UTP ilisogea Da 306, na molekuli ya protini ya GTP ilisogea Da 345, ikionyesha kwamba kila molekuli ya nsp9 hufunga UMP au GMP. (Picha 4) C na D).Inakisiwa kuwa nishati inayohitajika kwa NMPylation ya NiRAN-mediated nsp9 inatoka kwa hidrolisisi ya NTP na kutolewa kwa pyrofosfati.Ijapokuwa ongezeko la mara 10 la molar ya nsp9 (lengo) kuliko nsp12 (enzyme) ilitumiwa katika majibu haya, NMPylation karibu kamili ya nsp9 ilizingatiwa, ikionyesha kwamba mwingiliano kati ya nsp12 na nsp9 ni wa muda mfupi, na nsp12 inaweza NMPylate zaidi nsp9 molekuli ya vitro.

NMPylation Moja ya nsp9 mbele ya nsp12 na UTP au GTP.Inayoonyeshwa ni wigo kamili wa protini ambao haujachanganyika wa HCoV-229E nsp9 (kiambatisho cha SI, Jedwali S1) (AD).(A) nsp9 peke yake, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 mbele ya UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 mbele ya GTP.

Ili kubainisha mabaki ya nsp9 UMPylated na nsp12, nsp9-UMP ilipasuliwa na trypsin.Peptidi zilizotokana zilitenganishwa na kromatografia ya utendakazi wa hali ya juu ya nano (HPLC) na kuchanganuliwa na tandem mass spectrometry (MS/MS) mtandaoni.Uchambuzi wa data kwa kutumia kifurushi cha programu cha Byonic (Metriki za Protini) ulionyesha UMPylation ya asidi ya amino ya N-terminal.Hii inathibitishwa kwa mikono.Wigo wa wingi wa sanjari wa peptidi tangulizi [UMP]NNEIMPGK ( kiambatanisho cha SI, Kielelezo S5A) ulifichua kipande cha 421 m/z, ikionyesha kuwa UMP inafungamana na mabaki 1 ya nsp9.

Katika N-terminus ya nsp9, Asn inahifadhiwa miongoni mwa wanachama wa Orthocoronavirinae (Kiambatisho cha SI, Kielelezo S6).Ingawa tunaamini kuwa nitrojeni ya msingi ya amini ya N-terminal ndiyo ina uwezekano mkubwa wa kukubali UMP, tuliamua kupata ushahidi wa ziada wa kumfunga NMP kwenye kituo cha N.Kwa sababu hii, peptidi ya N-terminal isiyo ya NMPylated na NMPylated nsp9 iliyosafishwa na HPLC ilitolewa mbele ya asetoni na cyanoborohydride ya sodiamu.Chini ya masharti haya, amini za msingi za bure pekee zinaweza kubadilishwa na propyl (25).Peptidi inayotokana na N-terminal nsp9 yenye mfululizo wa NNEIMPGK ina amini mbili msingi, moja kwenye N-terminus ya Asn na nyingine kwenye msururu wa kando wa Lys kwenye C-terminus.Kwa hiyo, vikundi vya propyl vinaweza kuletwa katika ncha zote mbili.Chromatogram za ioni zilizotolewa za peptidi zisizo za NMPylated zimeonyeshwa kwenye kiambatisho cha SI, Kielelezo S5B.Kama inavyotarajiwa, N-terminal na C-terminal (mono) propylated (SI appendix, Kielelezo S5B, njia ya juu) na peptidi dipropylated (SI appendix, Kielelezo S5B, njia ya chini) inaweza kutambuliwa.Mchoro huu hubadilika na matumizi ya peptidi ya NMPylated N-terminal ya nsp9.Katika kesi hii, peptidi za propylated za C-terminal pekee ndizo zinaweza kutambuliwa, lakini peptidi za propylated za N-terminal na peptidi dipropylated hazitambuliwi (Kiambatisho cha SI, Kielelezo S5C), ikionyesha kuwa UMP imehamishiwa kwenye amini ya msingi ya N-terminal Ili kuzuia hili. kikundi kutokana na kufanya mabadiliko.

Kisha, tunabadilisha (na Ala au Ser) au kufuta mabaki yaliyohifadhiwa kwenye N-terminus ya nsp9 ili kufafanua vikwazo vya lengo mahususi.Kulingana na data yetu ya MS inayoonyesha kuwa NiRAN huunda kiambatisho cha nsp9-NMP na amini msingi wa mabaki ya N-terminal ya nsp9, tulidhania kuwa nsp9 NMPylation inahitaji virusi kuu ya protease (Mpro, nsp5) kutoa nsp9 N-terminal kutoka. mtangulizi wake wa polyprotein.Ili kupima dhana hii, tulitoa protini ya mtangulizi nsp7-11 iliyo na nsp9 katika E. koli na kufanya mtihani wa kawaida wa NMPylation mbele ya [α-32P] UTP (nyenzo na mbinu).Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 5A (njia ya 3), kitangulizi cha nsp7-11 ambacho hakijakatwa hakijawekwa alama ya redio na nsp12.Kinyume chake, ikiwa nsp7-11 imevunjwa na recombinant nsp5 ili kutoa nsp9 (na nsps zingine) kutoka kwa kitangulizi, protini yenye lebo ya redio ambayo huhama na nsp9 hugunduliwa, kuthibitisha hitimisho letu kwamba NiRAN na N- Uundaji Teule wa viunganishi vya nsp9-NMP. .Amine ya msingi ya mwisho ya N-terminal Asn (nafasi 3825 katika pp1a/pp1ab).Hitimisho hili pia linaungwa mkono na majaribio ya kutumia muundo wa nsp9, ambao una mabaki moja au mawili ya ziada kwenye N-terminus.Katika visa vyote viwili, UMPylation ya NiRAN-mediated ya nsp9 ilikomeshwa (Kiambatisho cha SI, Kielelezo S7).Kisha, tulitoa protini iliyo na masalia moja au mawili ya Asn yaliyofutwa kutoka kwa mlolongo wa peptidi 3825-NNEIMPK-3832 kwenye N-terminal ya nsp9.Katika visa vyote viwili, nsp9 UMPylation ilizuiwa kabisa (Kielelezo 5B), ikitoa ushahidi wa ziada kwamba nsp9 N-terminus halisi hufanya kazi kama kipokezi cha NMP.

Uchakataji wa proteolytic wa nsp9 na jukumu la mabaki ya N-terminal katika UMPylation inayopatanishwa na nsp12.(A) nsp9 UMPylation inahitaji nsp9 N-terminal isiyolipishwa.Nsp7-11-His6 imeamilishwa awali ifikapo 30 °C katika bafa ya kugundua NMPylation iliyo na UTP ikiwapo au kutokuwepo kwa kiambatanisho cha Mpro (nsp5-His6).Baada ya saa 3, anza jaribio la NMPylation kwa kuongeza nsp12-His6 kama ilivyoelezwa katika Nyenzo na Mbinu.Majibu yaliyo na nsp5-His6 (njia ya 1) na nsp9-His6 (njia ya 2) ilitumiwa kama kidhibiti.Baada ya dakika 10, majibu yalikomeshwa na mchanganyiko wa majibu ulitenganishwa na SDS-PAGE.Protini ilitiwa rangi ya Coomassie Brilliant Blue (A, juu).Kitangulizi cha Nsp7-11-His6 na bidhaa iliyochakatwa kutokana na upatanishi wa nsp5-His6 zinaonyeshwa upande wa kulia.Tafadhali kumbuka (kutokana na udogo wao) kwamba nsp7 na nsp11-His6 hazitambuliki kwenye jeli hii, na majibu huongezewa na nsp5-His6 (njia 1 na 4; nafasi ya nsp5-His6 inaonyeshwa na duara thabiti) au nsp9-His6 (Njia ya 2) ina kiasi kidogo cha MBP (iliyoonyeshwa na miduara iliyo wazi) kama uchafu uliobaki kwa sababu inaonyeshwa kama protini za mchanganyiko wa MBP ( kiambatisho cha SI, Jedwali S1).(B) Kibadala cha Nsp9-His6 hakina mabaki ya N-terminal ya Asn moja au mbili (mabaki ya nambari kulingana na nafasi katika pp1a/pp1ab) na husafishwa na kuingizwa kwa nsp12-His6 na [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE iliyotiwa rangi ya Coomassie imeonyeshwa juu, B, tauti inayolingana inaonyeshwa chini.Msimamo wa alama ya uzito wa Masi (katika kilodaltons) umeonyeshwa upande wa kushoto.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal iliyohifadhiwa ilibadilishwa na Ala au Ser, na kiwango sawa cha protini kilitumiwa katika mmenyuko wa UMPylation uliopatanishwa wa nsp12-His6.Bidhaa za mwitikio zilitenganishwa na SDS-PAGE na kupakwa rangi ya Coomassie Brilliant Blue (C, juu), na yenye lebo ya radio nsp9-His6 iligunduliwa na picha ya phosphorescence (C, katikati).Kwa kutumia protini ya aina-mwitu (wt) kama marejeleo (iliyowekwa hadi 100%), shughuli ya NMPylation ya jamaa (maana ± SEM) ilikokotolewa kutoka kwa majaribio matatu huru.(D) Viini vya virusi katika seli ya p1 ya chembe kuu ya seli za Huh-7 zilizoambukizwa na seli za HCoV-229E za aina ya Huh-7, na vibadilishaji vilivyobeba vibadala vilivyobainishwa vya asidi ya amino katika nsp9 vilibainishwa kwa uchunguzi wa plaque.Motifu ya RdRp yenye upungufu wa kurudia C double mutant DD4823/4AA ilitumika kama kidhibiti hasi.

N-terminus ya nsp9 (hasa nafasi 1, 2, 3, na 6) imehifadhiwa sana kati ya wanachama wa familia ndogo ya Orthocoronavirinae ( kiambatisho cha SI, Kielelezo S6).Ili kusoma uwezekano wa jukumu la masalia haya katika NMPylation ya nsp12-mediated nsp9, mabaki mawili ya Asn mfululizo kwenye N-terminus ya nsp9 yalibadilishwa na Ala au Ser (peke yake au kwa mchanganyiko).Ikilinganishwa na aina ya mwitu nsp9, kuchukua nafasi ya N3825 na Ala au Ser kulisababisha kupunguzwa kwa zaidi ya mara mbili katika UMPylation ya nsp12-mediated (Kielelezo 5C).Sambamba na hitimisho letu kwamba NMPylation hutokea kwenye amini ya msingi ya N-terminal badala ya mnyororo wa kando wa mabaki ya N-terminal, tuliona NMPylation muhimu ya mabaki na uingizwaji wa N3825A na N3825S.Inafurahisha, ikiwa Asn ya pili inabadilishwa na Ala au Ser, nsp9 UMPylation imepunguzwa kwa nguvu zaidi (zaidi ya mara 10), wakati uingizwaji wa Ala kwenye nafasi 3, 4, na 6 una athari ya wastani tu kwenye nsp9 UMPylation (Mchoro 2). ).5C).Matokeo sawa yalipatikana kwa kutumia ATP, CTP au GTP (kiambatisho cha SI, Kielelezo S8).Kwa pamoja, data hizi zinaonyesha jukumu muhimu la N2826 (nafasi ya 2 katika nsp9) katika NMPylation ya nsp9.

Ili kupata ushahidi wa ziada wa uwiano wa utendaji kazi kati ya N-terminus ya nsp9 na NMPylation, tulifanya upatanisho wa mfuatano mwingi (MSA) wa mfuatano wa nsp9 wa ​​familia ya Virusi vya Korona (kutofautiana kati ya mabaki 104 na 113) (Kiambatisho cha SI, Kielelezo. S6).Kwa jumla, katika spishi 47 (zinazojulikana na za kuweka) za jenasi 5 za familia ndogo ya Orthocoronavirinae ambazo huambukiza mamalia tofauti, ndege, na wanyama watambaao, ni mabaki 8 tu kwa jumla yalipatikana kuwa ya kutobadilika.Mabadiliko makubwa zaidi, ikiwa ni pamoja na kufutwa na kuingizwa, yalizingatiwa katika mizunguko kati ya vipengele vya muundo wa sekondari wa nsp9, kama ilivyoamuliwa na masomo ya awali ya kimuundo (26 ??28).Mabaki matano yasiyobadilika yalipatikana katika uzi wa β na α hesi ya sehemu ya C-terminal ya nsp9.Masalio matatu yasiyobadilika yanaunda motifu ya NNE ya mwisho wa N ya nsp9.Imefichuliwa kuwa Asn ya pili ya motifu hii ndiyo mabaki ya pekee yasiyobadilika, ambayo pia yanashirikiwa na nadharia dhahania ya nsp9 ya virusi vya corona vinavyohusiana kwa mbali, na inawakilisha spishi ya Microhyla letovirus 1 katika familia ndogo ya Letovirinae ya Alphaletovirus.Uhifadhi wa masalia katika vipengele vya muundo wa pili wa nsp9 unaweza kusawazishwa kwa kuzingatia kimuundo ili kudumisha kukunja au sifa zinazojulikana za RNA.Hata hivyo, hoja hii haionekani kutumika kwa uhifadhi wa NNE, na kabla ya utafiti huu, asili ya vikwazo vinavyozuia tofauti ya mlolongo wa tripeptide ilifichwa kabisa.

Ili kubaini umuhimu wa nsp9-NMPylation na uhifadhi wa NNE katika ujinaji wa virusi vya corona, tulitengeneza mutants za HCoV-229E, ambazo hubeba ubadilishaji mmoja au mara mbili wa masalia ya nsp9 N-terminal, ikionyesha kuwa nsp9 NMPylation ni hatari katika vitro.Kabla hatujaanza, tunajaribu kujibu swali ikiwa vibadala hivi (karibu na tovuti ya nsp8|9) vinaathiri uchakataji wa proteolytic wa eneo la C-terminal pp1a.Seti ya miundo ya poliproteini ya nsp7-11 iliyo na vibadala sambamba kwenye N-terminus ya nsp9 ilitolewa katika E. koli na kukatwa na recombinant Mpro.Mgawanyiko wa proteolytic wa tovuti nne (pamoja na tovuti ya pembeni ya nsp9) hauathiriwi kwa kiasi kikubwa na vibadala vilivyoletwa (kiambatanisho cha SI, Kielelezo S9), bila kujumuisha mabadiliko ya kimuundo katika protini hizi ambayo huingilia kati na mpasuko wa Mpro-mediated nsp8|9 ( Au nyinginezo) tovuti.

Seli za Huh-7 zilipitishwa kwa urefu wa jeni HCoV-229E RNA, ikisimba mbadala za Ala au Ser katika tripeptides za NNE (N3825, N3826, na E3827) zilizohifadhiwa kwenye mwisho wa nsp9 N, kuonyesha kwamba mabadiliko mengi ni hatari.Tuliweza kuokoa virusi kwa kuchukua nafasi ya Ser au Ala ya N-terminal Asn (N2835A au N2835S), lakini tulishindwa kurejesha virusi kwa mabadiliko mengine moja na mawili katika mlolongo wa NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Kielelezo 5D).

Matokeo haya yanaonyesha kuwa urudufishaji wa coronavirus katika utamaduni wa tishu umezuiwa (sawa au sawa), na kupunguza mabadiliko ya asili ya tovuti za NMPylation za nsp9 mwilini, na kuunga mkono jukumu kuu la jibu hili katika mzunguko wa maisha wa coronaviruses.

Katika seti ya mwisho ya majaribio, tulitoa C-terminal His6 inayoitwa SARS-CoV-2 nsp12 na nsp9, na aina mbili za mutant za nsp12 katika E. coli.Mabaki ya tovuti amilifu katika vikoa vya NiRAN na RdRp yalifuatana Tumia Ala badala yake (Mchoro 6A na kiambatisho cha SI, Jedwali S2).K4465 katika SARS-CoV-2 nsp12 inalingana na K4135 katika HCoV-229E (Kiambatisho cha SI, Kielelezo S2), ambayo ilithibitika kuhitajika kwa shughuli za NiRAN na urudufishaji wa HCoV-229E (Mchoro 3D na E).Salio hili pia linalingana na mabaki ya virusi vya arterial EAV nsp9 K94, ambayo hapo awali ilionyeshwa kuwa muhimu kwa NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16).Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 6B, SARS-CoV-2 nsp12 ina shughuli ya UMP ya kuhamisha kwa kutumia nsp9 kama sehemu ndogo, wakati kibadilishaji cha tovuti amilifu cha nsp12_K4465A hakitumiki.Ubadilishaji maradufu katika mfuatano wa sifa wa SDD wa motifu C ya RdRp hauathiri shughuli ya uhamisho wa UMP (Mchoro 6B), ikionyesha kuwa shughuli ya RdRp haina athari ya moja kwa moja katika nsp9 UMPylation.Data sawa ilipatikana kwa kutumia CTP, GTP na ATP (kiambatisho cha SI, Kielelezo S10).Kwa muhtasari, data hizi zinaonyesha kuwa NMPylation ya NiRAN-mediated nsp9 ina shughuli ya kihafidhina katika coronaviruses inayowakilisha aina tofauti za familia ndogo ya orthocoronavirus.

SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation ya nsp9.(A) Geli ya Coomassie iliyotiwa rangi ya SDS-polyacrylamide inayoonyesha protini recombinant iliyotumika katika jaribio la NMPylation.Kama udhibiti, protini inayobadilika yenye uwekaji wa tovuti amilifu katika kikoa cha NiRAN (K4465A) na kikoa cha RdRp (DD5152/3AA) cha SARS-CoV-2 nsp12 ilitumika.Uwekaji nambari wa masalio unatokana na nafasi katika pp1ab.(B) Otoradiografia ya utambuzi wa UMPylation kwa kutumia nsp9-His6 na [α-32P]UTP kama sehemu ndogo ya nsp12-His6 (aina ya mwitu [wt] na mutant).Masi ya molekuli (katika kilodaltons) ya protini iliyoandikwa inaonyeshwa upande wa kushoto.

Vikoa vya NiRAN kwa ujumla huhifadhiwa katika Nidovirales (16), ikionyesha kwamba huchochea athari za enzymatic muhimu kwa urudufishaji wa Nidovirus.Katika utafiti huu, tuliweza kuthibitisha kwamba kikoa cha NiRAN cha virusi vya corona huhamisha NMP (iliyozalishwa kutoka NTP) hadi nsp9, protini ya ajabu ya RNA inayofunga inayohusika katika urudufishaji wa virusi (26 ?? 29), ili kubainisha kama shabaha ya asili na mshirika wa coronavirus RTC.

Kikoa cha NiRAN kinashiriki motifu tatu za mfuatano (AN, BN, na CN), ambazo zina idadi ndogo sana ya mabaki ambayo yanahifadhiwa katika familia zote katika utaratibu wa monophyletic lakini tofauti sana wa Nidovirales (8, 16) .Uchunguzi wa hivi majuzi umeonyesha kuwa zinahusiana kimuundo na familia isiyo na sifa ya protini-kama-protini kinase, ambayo awali iliitwa familia ya SelO (17, 19, 22, 30, 31).Protini zinazohusiana na SelO zina mikunjo ya kinase, lakini hazina mabaki kadhaa ya tovuti yaliyohifadhiwa katika kinasi ya zamani (22, 32).Kulingana na mwelekeo wa kinyume wa molekuli za ATP zinazofungamana na tovuti inayofanya kazi na kusaidiwa na mwingiliano maalum, SelO ilifikiriwa na hatimaye kuthibitishwa kuhamisha AMP (badala ya phosphate) hadi kwenye substrate ya protini (22), wakati protini nyingine ya bakteria inayofanana na SelO, YdiU ina. hivi majuzi imeonyeshwa ili kuchochea kiambatisho cha ushirika cha UMP kwa Tyr na mabaki yake ya substrates tofauti za protini (33).

Ili kuthibitisha na kupanua utabiri wa masalia ya tovuti yanayotumika ya kikoa cha NiRAN, tulitumia mbinu za kibiokemikali na za kinyume cha maumbile kufanya uchanganuzi wa mabadiliko kwenye virusi vya korona nsp12 (Kielelezo 3D na E na nyongeza ya SI, Mchoro S3 na jedwali) S1â S4).Data inaonyesha kuwa uingizwaji wa HCoV-229E K4135, R4178 na D4280 na Ala huondoa shughuli ya uhamishaji wa NMP katika vitro na uigaji wa virusi katika utamaduni wa seli (Mchoro 3D na E na SI viambatisho, Kielelezo S3), kusaidia uwepo wao katika NTP γ-fosfati. ( K4135, R4178) na uratibu wa ioni za chuma za tovuti zinazofanya kazi (D4280).Ubadilishaji wa E4145A wa Glu iliyohifadhiwa katika safu mbalimbali ya virusi vya kiota cha ndege iliyotabiriwa kuleta utulivu katika nafasi ya K4135 (17) ilionyeshwa ili kuondoa urudufu wa virusi, lakini cha kushangaza ni kwamba shughuli hiyo ilidumishwa katika majaribio ya in vitro ya NMPylation (Mchoro 3D na E na Kiambatisho cha SI, Kielelezo S3 Na Majedwali S1–S4).Uchunguzi sawa ulifanywa wakati uingizwaji sambamba ulipoanzishwa katika homologi ya YdiU ya Salmonella typhimurium (E130A) (33).Kwa pamoja, data hizi zinaunga mkono utendakazi wa udhibiti wa masalio haya yaliyohifadhiwa badala ya utendaji kazi wa kichocheo.

Kubadilisha mabaki ya Phe (F4281A) yaliyohifadhiwa ndani ya anuwai ya nestovirus katika kikoa cha HCoV-229E NiRAN (8) ilisababisha kupungua kwa shughuli za NMPylation katika vitro na kupungua kwa uzazi wa virusi katika utamaduni wa seli (Mchoro 3D, E na SI) kiambatisho, Kielelezo S3).Data inalingana na utendakazi muhimu wa udhibiti wa masalio haya, kama vile mabaki ya motifu ya DFG Phe iliyoonyeshwa hapo awali.Katika kinasi za protini za kitamaduni, ni sehemu ya kitanzi kinachofunga cha Mg2+ na husaidia kukusanyika na kudhibiti mgongo???Inahitajika kwa shughuli bora ya kichocheo (32, 34).Kubadilisha Ala na Arg kwa mabaki ya K4116 (katika motifu ya preAN), mtawalia, kuliondoa urudufuaji wa virusi na, kama ilivyotarajiwa, kulikuwa na athari tofauti kwenye shughuli ya uhamishaji wa NMP katika vitro, kulingana na mnyororo wa upande wa asidi ya amino ulioletwa (Kielelezo 3D Na E na viambatisho vya SI. , Kielelezo S3).Data ya kazi inalingana na maelezo ya kimuundo, inayoonyesha kuwa mabaki haya yameanzisha mwingiliano na ATP phosphate (17).Katika kikoa cha NiRAN cha familia zingine za virusi zilizowekwa kiota, nafasi ya HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 inashikiliwa na Lys, Arg au His (8), ikionyesha kuwa kizuizi cha utendaji cha masalio haya mahususi kimelegezwa.Uingizwaji wa D4188A na D4283A huondoa au hupunguza sana shughuli za kimeng'enya na huondoa uzazi wa virusi (Mchoro 3).Masalio haya mawili yamehifadhiwa katika virusi vingi (lakini si vyote) vilivyowekwa kwenye viota (8), ikionyesha utendaji muhimu wa familia mahususi lakini pengine usio wa kichocheo.Ubadilishaji wa Ala wa mabaki kadhaa ya Lys na Asp (K4113A, D4180A, D4197A na D4273A) ambayo hayajahifadhiwa katika Coronaviridae au familia zingine za Nestioviridae (8) zilitumika kama udhibiti.Kama inavyotarajiwa, vibadala hivi kwa kiasi kikubwa vinaweza kuvumiliwa, na kupungua kidogo kwa shughuli za kimeng'enya na urudiaji wa virusi katika visa vingine (Mchoro 3 na kiambatisho cha SI, Mchoro S3).Kwa ujumla, data ya mutagenesis ya coronavirus inalingana sana na self-GMP na data ya nyuma ya jenetiki ya EAV NiRAN-RdRp (16), ambamo mabaki ya EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) K94 (yanayolingana na HCoV- 229E K4135) kazi muhimu), R124 (inayolingana na R4178), D132 (inayolingana na D4188), D165 (inayolingana na D4280), F166 (inayolingana na F4281).Kwa kuongezea, data ya mutagenesis ya HCoV-229E inalingana na kupanuliwa kutoka kwa data iliyoripotiwa hapo awali ya reverse genetics ya SARS-CoV (16), sawa na ile iliyozingatiwa kwa motisha inayolingana ya CN Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The phenotype ilivyoelezwa -F219A na HCoV-229E_F4281A (Kielelezo 3 D na E na kiambatisho cha SI, Kielelezo S3 na Jedwali S1-S4).

Ikilinganishwa na orthologi za EAV (16), ambazo zina upendeleo wazi kwa UTP na GTP (katika athari ya NMPylation ya kibinafsi), utafiti wetu unaonyesha kuwa kikoa cha NiRAN cha coronavirus (kinachowakilishwa na HCoV-229E na SARS-CoV-2) kinaweza kuwa bora. kuhamishwa NMP zote nne, ingawa kuna upendeleo kidogo kwa UMP (Kielelezo 1 na 3).Umaalumu wa chini kiasi wa substrate-shirikishi mahususi ya NTP inalingana na muundo wa kiunzi cha juu zaidi wa SARS-CoV-2 ulioripotiwa hivi majuzi, ambapo ADP-Mg2+ hufungamana na tovuti inayotumika ya NiRAN, lakini si na Sehemu ya adenine. ya malezi ya mwingiliano maalum (17).Katika somo letu, aina ya nyukleotidi inayotumika katika mmenyuko wa NMPylation haina athari tofauti kwenye shughuli ya protini inayobadilika (Kiambatisho cha SI, Kielelezo S3), ikionyesha kuwa hakuna mabaki haya yanayohusiana kwa karibu na kuunganishwa kwa nucleobase maalum.Msingi wa kimuundo na umuhimu wa kibayolojia unaowezekana wa mapendeleo tofauti ya sehemu ndogo ya NTP yanayozingatiwa katika vikoa vya NiRAN vya virusi vya corona na virusi vya ateri vinasalia kuchunguzwa;yanaweza kuwa ya kweli au yanaweza kutokana na mapungufu ya masomo yao husika.Kwa sasa, haiwezi kuamuliwa kuwa shughuli inayowezekana ya NMPylator ya kikoa cha NiRAN cha virusi vya ateri (ikilinganishwa na shughuli ya awali ya NMPylation) ina upendeleo tofauti wa substrate, kwa kuzingatia kwamba kufanana kati ya arterial na coronavirus. Kikoa cha NiRAN kiko kwenye kikomo chake.Kulingana na mfuatano Linganisha (16).Ikilinganishwa na pseudokinase SelO, ambayo hutumia Mg2+ kama cofactor, shughuli ya virusi vya corona na virusi vya NiRAN inategemea Mn2+ (16) (Mchoro 3C na nyongeza ya SI, Mchoro S1).Utegemezi wa Mn2+ na upendeleo dhahiri wa UTP ni sifa isiyo ya kawaida ya NMPylators za protini, na imethibitishwa hivi majuzi tu katika protini ya YdiU ya Salmonella typhimurium, ambayo huchochea UMPylation ya protini inayotegemewa na Mn2+ ili kulinda seli dhidi ya dimbwi la kuingiza seli ya ATP ( 33).

Usawa wa muundo uliofafanuliwa hivi majuzi kati ya kikoa cha NiRAN cha coronavirus na kinasi ya protini ya seli (17, 19) hutoa usaidizi wa ziada kwa uwezo wa NiRAN wa kuunganisha kwa ushirikiano NMP na protini zingine ambazo tumeripoti katika utafiti huu.Tuliangazia utafutaji wetu wa shabaha zinazowezekana za NiRAN kwenye protini zilizosimbwa na HCoV-229E ORF1a, ambazo zinajulikana kusaidia moja kwa moja au kwa njia isiyo ya moja kwa moja nakala iliyosimbwa ya RTC ya ORF1b (12, 35).Majaribio yetu yanatoa ushahidi kamili kwa NMPylation bora na mahususi ya nsp9 (Mchoro 2).Ikiwa protini inayolengwa inatumiwa katika ziada ya molari ambayo ni mara 8 hadi 10 zaidi ya ile ya kimeng'enya (nsp12), inathibitishwa kuwa nsp9 ni kabisa (mono)NMPized (Mchoro 4).Tulihitimisha kuwa mwingiliano kati ya nsp12 na nsp9 ni wa muda mfupi na hautaunda tata thabiti na nsp9 (bila kukosekana kwa vitengo vingine vya RTC).Hitimisho hili linaungwa mkono na tafiti za mwingiliano wa protini kwenye proteome ya SARS-CoV (35).Uchanganuzi wa MS ulibainisha amini msingi wa mabaki ya N-terminal ya nsp9 kama tovuti ya NMPylation ( kiambatisho cha SI, Kielelezo S5).Uundaji wa dhamana ya phosphoramidate na kikundi cha amino cha N-terminal hutofautisha shughuli ya NMPylation ya NiRAN kutoka kwa mmenyuko wa Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation, ambayo huchochea uundaji wa O-linked AMP katika Ser, Thr, au Tyr mabaki ya Peptide adduct ( 22), na S. typhimurium YdiU huunda O-zilizounganishwa (na Tyr) na N-zilizounganishwa (na Yake) peptide-UMP.Taarifa chache zinazopatikana kwenye familia ya SelO ya protini zinaonyesha kuwa washiriki wa familia hii kubwa ya protini hutofautiana sana katika uundaji wa viongeza vya peptidi-NMP.Huu ni uchunguzi wa kuvutia ambao unastahili kujifunza zaidi.

Data iliyopatikana katika utafiti huu ilituongoza kudhania kuwa NMPylation ya nsp9 inahitaji N-terminus isiyolipishwa.Katika muktadha wa urudiaji wa virusi, hii itatolewa na mpasuko wa proteolytic wa tovuti ya usindikaji ya nsp8|nsp9 katika nakala ya polyprotein pp1a inayopatanishwa na Mpro na pp1ab.Katika virusi vingi vya corona, tofauti kati ya tovuti hii mahususi (VKLQ|NNEI katika HCoV-229E) na tovuti zingine zote za kupasua kwa virusi vya Mpro ni Asn (badala ya mabaki mengine madogo, kama vile Ala, Ser Au Gly) huchukua P1â???Mahali (36).Data ya upasuaji wa peptidi iliyopatikana katika tafiti za awali ilionyesha kuwa ufanisi wa upasuaji wa tovuti ya nsp8|nsp9 ulikuwa wa chini kuliko ule wa tovuti zingine, ikionyesha kwamba 1) tovuti hii mahususi inaweza kuwa na jukumu la udhibiti katika uchakataji ulioratibiwa kwa wakati wa C-terminal. pp1a eneo, au 2) a Jukumu la nsp9 N-terminus maalum iliyohifadhiwa katika urudiaji wa virusi (37).Data yetu (Kielelezo 5A) ilionyesha kuwa aina ya recombinant ya nsp9 iliyobeba mfuatano halisi wa N-terminal ilifanywa NMP kwa nsp12 kwa ufanisi.Mfuatano wa N-terminal flanking uliondolewa na factor Xa (nsp9-His6; SI appendix, Jedwali S1) au Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6; Kielelezo 5A na SI kiambatisho, Jedwali S1).Muhimu zaidi, kitangulizi cha nsp9-chenye nsp7-11-His6 ambacho hakijakatwa kilionyesha upinzani dhidi ya NMPylation ya nsp12, ambayo inalingana na data yetu, ikionyesha kuwa kiambatisho cha nsp9-NMP kinaundwa kupitia amini ya msingi ya N-terminal ( kiambatanisho cha SI, Kielelezo S5) .Ili kupata uelewa wa kina wa umaalum wa substrate ya NiRAN, kisha tuliangazia masalio ya N-terminal yaliyo karibu ya nsp9.Kwa kukosekana kwa protini zingine, zinaweza kubadilika kimuundo, na kuzizuia zisigunduliwe katika fomu isiyo na lebo ya nsp9 (26 28, 38), ikionyesha utofauti wao wa asili. kazi ya kipande cha N-terminal cha nsp9.Ubadilishaji wa Ala wa mabaki yaliyohifadhiwa katika eneo hili (Kielelezo 5C na D na kiambatisho cha SI, Kielelezo S8) unaonyesha kuwa N3826 ni muhimu kwa nsp9 NMPylation in vitro, wakati N3825A na E3827A mbadala husababisha kupungua kwa NMPylation, wakati M3829A na P38 mbadala. .Ni wazi kuathiri nsp9 NMPylation.Ingawa uingizwaji wa N-terminal Asn (N3825A, N3825S) una athari ya wastani tu kwa nsp9 NMPylation na urudufishaji wa virusi katika utamaduni wa seli (Mchoro 5C na D), kufutwa kwa mlolongo wa masalio ya Asn kutoka kwa dipeptidi ya N-terminal 3825-NN. imethibitishwa kuwa Ni hatari kwa virusi, ikionyesha kwamba mabaki ya Asn moja yanahitajika kabla ya mabaki mengine kwenye N-terminus, ikiwezekana Asn, ingawa inaonekana kwamba uingizwaji wa masalia sawa unaweza kuvumiliwa kwa kiasi (Mchoro 5B, C, na D).Tunahitimisha kuwa dipeptidi ya 3825-NN, hasa mabaki ya N3826 yaliyohifadhiwa na muhimu ndani ya safu ya virusi vya corona (kiambatisho cha SI, Kielelezo S6), huhakikisha ufungaji na mwelekeo sahihi wa nsp9 N-terminus katika tovuti inayotumika ya NiRAN.

Kubadilisha Ala (E3827A) kwa Glu iliyohifadhiwa ya familia ndogo zote huhifadhi nsp9 NMPylation in vitro lakini ni hatari kwa virusi katika utamaduni wa seli (Kielelezo 5C na D), ikionyesha utendakazi wa ziada wa masalio haya, kwa mfano, katika mwingiliano muhimu (NMPylated au isiyobadilishwa. ) nsp9 N-terminus na mambo mengine yanayohusika katika urudiaji wa virusi.Mabadiliko ya Nsp9 hayakuathiri mchakato wa proteolytic wa nsp9 au nsps yoyote iliyo karibu (39) (Kiambatisho cha SI, Kielelezo S9), ikionyesha kwamba phenotypes hatari za mabadiliko kadhaa ya nsp9 zilizozingatiwa hazikusababishwa na kutodhibitiwa kwa mchakato wa C proteolytic-terminal pp1a. .

Data iliyo hapo juu inatoa ushahidi kwamba baada ya matibabu ya Mpro-mediated ya nsp8|9 tovuti ya kupasua katika pp1a/pp1ab, N-terminus ya nsp9 inaweza kuwa UMPylated (au kurekebishwa kwa kiasi na NMP nyingine).Kwa kuongezea, uhifadhi bora wa N-terminus ya nsp9 (pamoja na umoja na mabaki ya Asn yasiyobadilika katika familia ya coronavirus) na data ya nyuma ya jenetiki iliyopatikana katika utafiti huu (Kielelezo 3E na 5D) ilituongoza kuhitimisha kwamba NMPylation ya nsp9 iliyofafanuliwa. inahusiana kibayolojia na ni muhimu kwa kujirudia kwa virusi vya corona.Matokeo ya utendaji ya urekebishaji huu yanasalia kuchunguzwa, kwa mfano, kuhusu shughuli iliyofafanuliwa hapo awali (isiyo maalum) nsp9 (fomu ambayo haijabadilishwa) shughuli ya kisheria ya RNA (2628).NMPylation ya N-terminal inaweza pia kuathiri mwingiliano wa nsp9 na protini au substrates za RNA au uundaji wa makusanyiko tofauti ya ngazi nne.Haya yamezingatiwa katika tafiti za kimuundo na yamethibitishwa kuwa yanahusiana kiutendaji na kurudia kwa coronavirus, ingawa haswa kwa kukosekana kwa Katika kesi ya marekebisho haya (26- ââ29, 40).

Ingawa umaalum unaolengwa wa kikoa cha NiRAN cha coronavirus bado unahitaji kubainishwa kwa undani zaidi, data yetu inaonyesha kuwa umaalum unaolengwa wa protini ya kikoa cha NiRAN ni finyu sana.Ingawa uhifadhi wa mabaki muhimu ya tovuti hai (8, 16) katika kikoa cha NiRAN cha familia zote za nidovirus inasaidia sana shughuli za NMPylator iliyohifadhiwa ya protini hizi, utambulisho wa mabaki ya mfukoni unaofunga substrate ya kikoa hiki Uhifadhi na uhifadhi unasalia kuainishwa. , na inaweza kutofautiana kati ya familia tofauti za madhumuni ya Nidovirales.Vile vile, shabaha zinazofaa za virusi vingine vilivyowekwa kwenye kiota bado hazijaamuliwa.Wanaweza kuwa othologi za mbali za nsp9 au protini nyingine, kwa sababu mfuatano nje ya vikoa vitano vya replicase ambavyo kwa ujumla huhifadhiwa katika virusi vilivyowekwa kwenye viota havijahifadhiwa (8), ikijumuisha safu ya jenomu kati ya Mpro na NiRAN, Miongoni mwao, nsp9 iko katika virusi vya korona.

Kwa kuongeza, hatuwezi kwa sasa kuondoa uwezekano kwamba kikoa cha NiRAN kina malengo ya ziada (ikiwa ni pamoja na simu za mkononi).Katika kesi hii, ni muhimu kutaja kwamba homologues za bakteria katika NMPylators za protini zinazojitokeza (NMPylators) (30, 31) zinaonekana kuwa na "wasimamizi wakuu"?NMP hurekebisha aina mbalimbali za protini za seli ili kudhibiti au kuondoa shughuli zao za chini, na hivyo kuchukua jukumu katika michakato mbalimbali ya kibaolojia, kama vile majibu ya dhiki ya seli na homeostasis ya redox (22, 33).

Katika utafiti huu (Kielelezo 2 na 4 na Kiambatisho cha SI, Kielelezo S3 na S5), tuliweza kuthibitisha kwamba nsp12 ilihamisha sehemu ya UMP (NMP) hadi nafasi moja (iliyohifadhiwa) katika nsp9, wakati protini nyingine hazikubadilishwa katika kutumika Chini ya masharti, maalum (badala ya huru) substrate maalum ni mkono.Sambamba na hili, ikilinganishwa na N-terminal nsp9 NMPylation, shughuli ya NMPylation ya nsp12 ni ndogo sana, ugunduzi wake unahitaji muda mrefu wa kufichua otoradiography, na ongezeko la mara 10 la ukolezi wa nsp12 hutumiwa.Kwa kuongezea, uchanganuzi wetu wa MS haukuweza kutoa ushahidi wa NMPylation ya nsp12, ambayo inapendekeza kuwa NMPylation ya kikoa cha NiRAN ni (bora zaidi) shughuli ya pili.Hata hivyo, ni lazima ieleweke kwamba tafiti nyingine zimetoa ushahidi wa awali kwamba hali ya kujitegemea AMPylation ya NMPylator ya bakteria inaweza kudhibiti shughuli zao za NMPylation kwenye substrates nyingine za protini (22, 33).Kwa hivyo, utafiti zaidi unahitajika ili kuchunguza athari zinazoweza kutekelezwa za shughuli za kujiendesha binafsi zilizoripotiwa kwa EAV nsp9 (16) na coronavirus nsp12 (utafiti huu), ikijumuisha madoido yanayopendekezwa kama chaperone kwenye ukunjwa wa kikoa cha C-terminal RdRp ( 16)).

Hapo awali, hypotheses kadhaa kuhusu uwezekano wa kazi za chini za kikoa cha nidoviral NiRAN zimezingatiwa, ikiwa ni pamoja na RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase na shughuli ya priming ya protini (16), lakini hakuna hata mmoja wao ni sambamba na kazi zilizopo chini ya mkondo.Taarifa zilizopatikana katika nafasi zifuatazo ni wakati huo huo bila kufanya mawazo ya ziada.Data iliyopatikana katika utafiti huu inalingana zaidi na (lakini haiwezi kuthibitisha) kwamba kikoa cha NiRAN kinahusika katika uanzishaji wa usanisi wa RNA unaotokana na protini.Hapo awali iliaminika kuwa kazi ya kikoa cha NiRAN katika 5 ??²-RNA capping au athari za kuunganisha RNA haziathiriwi na haya na Usaidizi wa data nyingine.Kwa hivyo, kwa mfano, tovuti inayotumika ya NiRAN inachukuliwa kuhusisha Asp iliyohifadhiwa kama msingi wa jumla (D252 katika Pseudomonas syringae SelO; D4271 katika HCoV-229E pp1ab; D208 katika SARS-CoV-2 nsp12) (Kiambatisho cha SI, kielelezo 2 )S2) (17, 22, 33), wakati kichocheo katika RNA ligase tegemezi ya ATP na RNA capping enzyme inafanywa na enzyme covalent-(lysyl-N)-NMP ya kati, ambayo inahusisha mabaki ya Lys yasiyobadilika. 41).Zaidi ya hayo, umaalumu wa ajabu unaotegemea mfuatano wa virusi vya corona NiRAN kwa malengo ya protini iliyohifadhiwa na umaalum uliolegea wa substrates za NTP (inapendelea UTP) hupinga kimeng'enya cha upatanishi cha NiRAN au vitendaji kama vile RNA ligase.

Kwa wazi, kazi nyingi za ziada zinahitajika ili kuthibitisha na, ikiwa imethibitishwa, kufafanua juu ya jukumu linalowezekana la nsp9-UMP (nsp9-NMP) katika usanisi wa RNA unaotokana na protini, ambayo itaunganisha ripoti kadhaa za kuvutia lakini (hadi sasa) zilizoripotiwa hapo awali. .Uchunguzi wa pekee.Kwa mfano, imedhamiriwa kuwa mwisho wa RNA-hasi ya coronavirus huanza na safu ya oligo(U) (42, 43).Uchunguzi huu unaendana na wazo kwamba uunganisho wa uzi-hasi wa RNA huanzishwa kwa kuunganisha umbo la UMPylated la nsp9 kwa mkia wa aina nyingi(A) ( vichochezi), ambao unaweza kukuzwa kwa kumfunga kwa RNA Shughuli na/au mwingiliano na protini nyingine ya RTC.Kisha sehemu ya UMP iliyotolewa na nsp9 inaweza kutumika kama "kitangulizi" cha nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation, kwa kutumia mkia 3??²-poly(A) katika RNA genomic au mfuatano mwingine wa oligo (A) hutumika kama kiolezo, sawa na utaratibu ulioanzishwa kwa protini ya picornavirus VPg (44).Je, ikiwa pendekezo ni "lisilo la kawaida"????Kuanzishwa kwa usanisi wa RNA (iliyotokana na protini)-hasi-hasi hutoa kiunga cha uchunguzi, ikionyesha kuwa RNA ya safu hasi ya coronavirus ina UMP (badala ya UTP) mwisho wake (42), ambayo inachukuliwa kuashiria kuwa asidi nucleiki Dicer hupasua mwisho wa fosforasi na endonuclease isiyojulikana ya uridine.Ikithibitishwa, shughuli hii ya hidrolitiki ya asidi ya nuklei inaweza kusaidia kutoa umbo la oligomeri UMPylated la nsp9 kutoka mwisho wa ² 5 wa ncha hasi changa.Jukumu linalowezekana la nsp9 katika uanzishaji wa protini pia linalingana na tafiti za awali za chembe za urithi, ambazo zimeonyesha kuwa nsp9 (na nsp8) huingiliana kwa umakini na mahususi na kipengele cha RNA kinachofanya kazi kwenye cis karibu na mwisho wa 3 wa jenomu ya coronavirus.45).Kulingana na ripoti hii, uchunguzi huu wa awali sasa unaweza kuangaliwa upya na kupanuliwa kupitia utafiti zaidi.

Kwa muhtasari, data yetu ilibainisha shughuli mahususi ya tegi ya vimeng'enya vya virusi vilivyounganishwa na RdRp kwenye N-terminus.Katika virusi vya corona, shughuli hii mpya ya UMPylator/NMPylator iliyopatanishwa na NiRAN inatumiwa kutegemea Mn2+ na mabaki ya Asn yaliyo karibu na kusababisha uundaji wa vifungo (vya nishati ya chini) vya phosphoramidate na amini ya msingi ya N-terminal.Kupitia upasuaji wa upatanishi wa Mpro kwenye tovuti ya nsp8|9 ya mpasuko, lengo la nsp9 linaweza kutumika kwa NMPylation, ikionyesha muunganisho wa utendaji kazi kati ya protease na kikoa cha NiRAN, ambacho kinaenea hadi RdRp.Uhifadhi wa masalia muhimu katika tovuti inayotumika ya NiRAN ya nsp12 na lengo la nsp9, pamoja na data iliyopatikana kutoka kwa virusi viwili vya corona ikiwa ni pamoja na SARS-CoV-2, unatoa ushahidi dhabiti kwamba nsp9 NMPylation ni coronavirus Vipengele vya kihafidhina pia ni hatua muhimu katika urudufu wa virusi.Data inayopatikana inatufanya tuhitimishe kuwa jukumu mahususi la aina ya NMPylated ya nsp9 katika usanisi wa RNA inayotokana na protini ni hali inayofaa kwa virusi vya corona na virusi vingine vilivyo kwenye viota, na NiRAN pia inaweza kulenga protini zingine ambazo hazijatambuliwa.Kudhibiti virusi.Mwingiliano wa mwenyeji.Ikithibitishwa, kuhusika kwa vianzio vya protini katika usanisi wa virusi vya RNA kutaongeza mshikamano wa mfuatano wa vikoa vya Mpro/3CLpro na RdRp kati ya virusi vya corona vilivyogunduliwa hapo awali na kundi kubwa kama la picornavirus (9), ambazo sasa zimeunganishwa katika Pisonivirites iliyoanzishwa hivi karibuni. 46) katika kategoria.

Data yetu pia inaonyesha kuwa shughuli za kimsingi, teule na za kihafidhina za kimeng'enya zilizobainishwa katika utafiti huu zinaweza kutumika kama shabaha za dawa za kuzuia virusi.Viambatanisho vinavyotatiza ufungaji (na urekebishaji unaofuata) wa nsp9 N-terminus iliyohifadhiwa kwenye tovuti inayotumika ya NiRAN inaweza kutengenezwa kuwa dawa bora na nyingi za kuzuia virusi, zinazofaa kwa matibabu ya virusi vya korona ya wanyama na binadamu kutoka kwa Maambukizi ya jenasi (ndogo). , ikijumuisha SARS-CoV-2 na Virusi vya Korona vya Ugonjwa wa Kupumua Mashariki ya Kati.

Mlolongo wa usimbaji wa protini ya virusi vya corona iliyozalishwa katika utafiti huu uliimarishwa na RT-PCR kwa kutumia RNA iliyotengwa na Huh-7 iliyoambukizwa HCoV-229E au Vero E6 iliyoambukizwa na SARS-CoV-2, na kuingizwa kwa kutumia taratibu za kawaida za upangaji.pMAL-c2 (Maabara ya Kibiolojia ya New England) au pASK3-Ub-CHis6 (47) vekta ya kujieleza (Kiambatisho cha SI, Jedwali S1 na S2).Single codon substitutions zilianzishwa na PCR-msingi tovuti-iliyoongozwa mutagenesis (48).Ili kuzalisha protini ya muunganisho wa MBP, seli za E. koli TB1 zilibadilishwa kwa muundo unaofaa wa pMAL-c2 wa plasmid ( kiambatisho cha SI, Jedwali S1).Protini ya muunganisho ilisafishwa kwa kromatografia ya uhusiano wa amylose na kushikana na factor Xa.Baadaye, protini ya C-terminal His6-tagged ilisafishwa na Ni-immobilized chuma mshikamano chromatography (Ni-IMAC) kama ilivyoelezwa hapo awali (49).Ili kuzalisha protini ya muunganisho wa ubiquitin, seli za E. koli TB1 zilitumia muundo unaofaa wa pASK3-Ub-CHIs6 wa plasmid (Kiambatisho cha SI, Majedwali S1 na S2) na pCGI ya usimbaji wa DNA ya plasmid ya ubiquitin-maalum C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Mabadiliko (47).Protini ya C-terminal His6-tagged coronavirus ilisafishwa kama ilivyoelezwa hapo awali (50).

Jaribio la kujirekebisha la HCoV-229E nsp12-His6 lilifanyika kama ilivyoelezwa katika EAV nsp9 (16).Kwa kifupi, nsp12-His6 (0.5 µM) ina 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mm dithiothreitol ( DTT), 6 mm MnCl2, 25 µM buffer NTP iliyobainishwa na 0.17 µM zililingana [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Uchanganuzi wa Hartmann) kwa 30 °C kwa dakika 30.Katika majaribio mengine yote (ya kawaida) ya NMPylation ya nsp12-mediated nsp9 NMPylation, hali ya majibu hurekebishwa kama ifuatavyo: nsp12-His6 (0.05 µM) na nsp9-His6 (4 µM) mbele ya 50 mm HEPES-KOH (pH 8.0) ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM iliyoashiriwa NTP, na 0.17 µM inalingana [α32-P]NTP.Baada ya kuangulia kwa dakika 10 kwa joto la 30°C, sampuli ya majibu ilichanganywa na bafa ya sampuli ya SDS-PAGE: 62.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% GLYCEROL na 0.005% bromophenol bluu.Protini ilibadilishwa kwa kuongeza joto ifikapo 90 °C kwa dakika 5 na kutenganishwa kwa 12% SDS-PAGE.Geli hiyo imewekwa na kuchafuliwa na myeyusho wa Coomassie Brilliant Blue (40% methanoli, 10% asidi asetiki, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), imeondolewa rangi, na kufichuliwa kwenye skrini ya kupiga picha ya fosforasi kwa saa 20 (ili kutambua nsp12 kutoka NMPylation) au (kiwango cha juu) Saa 2 (kutathmini NMPylation ya nsp9).Picha ya Typhoon 9200 (GE Healthcare) ilitumiwa kuchanganua skrini na ImageJ ilitumiwa kuchanganua ukubwa wa mawimbi.

Kwa uchanganuzi wa MS, 1 µM nsp12-His6 na 10 µM nsp9 (bila lebo ya hexahistidine) zilitumika katika uchanganuzi wa NMPylation (kiambatisho cha SI, Jedwali S1) na ukolezi ulioongezeka wa 500 µM UTP na GTP zilitumika.Kulingana na mkusanyiko wao na ubora wa protini unaotarajiwa, mfumo wa Waters ACQUITY H-Class HPLC ulio na safu wima ya MassPrep (Waters) ulitumiwa kutengenezea 1 hadi 10 µL za suluhu za protini zilizoakibishwa mtandaoni.Protini iliyotiwa chumvi hutolewa kwenye chanzo cha ayoni ya kielektroniki ya kipima spekromita ya wingi ya Synapt G2Si (Waters) kupitia kipenyo kifuatacho cha bafa A (maji/0.05% asidi fomi) na bafa B (asidi fomati ya asetonitrile/0.045%), na halijoto ya safu wima ni 60 ° C na kiwango cha mtiririko wa 0.1 mL/min: kutolewa kiisokrasia na 5% A kwa dakika 2, kisha kipenyo laini hadi 95% B ndani ya dakika 8, na kudumisha 95% B kwa dakika 4 nyingine.

Ioni chanya na safu ya wingi ya 500 hadi 5000 m/z hugunduliwa.Glu-fibrinopeptide B hupimwa kila sekunde 45 kwa urekebishaji wa kiotomatiki wa kuteleza kwa wingi.Tumia programu ya chombo cha MassLynx iliyo na kiendelezi cha MaxEnt1 ili kutenganisha wigo wa wastani baada ya kukata msingi na kulainisha.

UMPylated HCoV-229E nsp9 iliyeyushwa kwa kuongeza trypsin iliyorekebishwa ya kiwango cha mpangilio (Serva) na kuangaziwa usiku kucha saa 37 °C.Safu wima inayozunguka ya Chromabond C18WP (sehemu ya 730522; Macherey-Nagel) ilitumiwa kuondoa na kukazia peptidi.Hatimaye, peptidi iliyeyushwa katika 25 µL ya maji, ambayo ilikuwa na 5% asetonitrile na 0.1% ya asidi ya fomu.

Sampuli hizo zilichanganuliwa na MS kwa kutumia kipima sauti cha Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Mfumo wa mwisho wa nanoâ HPLC (Dionex), unao na mwisho wa kawaida uliowekwa 50 cm??Safu wima ya 75 μm C18 RP iliyojaa shanga za sumaku 2.4 μm (Dk. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Unganisha kwenye kipima sauti mtandaoni kupitia chanzo cha Proxeon nanospray;ingiza 6 µL ya myeyusho wa trypsin kwenye kipenyo cha ndani cha 300 µm ×??Sentimita 1 C18 safu wima ya mkusanyiko wa awali ya PepMap (Thermo Scientific).Kwa kutumia maji/0.05% ya asidi ya fomu kama kiyeyusho, sampuli ilinaswa kiotomatiki na kutolewa chumvi kwa kiwango cha mtiririko cha 6 µL/min.

Gradients zifuatazo za asidi ya maji/0.05% ya asidi ya fomu (kimumunyisho A) na 80% asetonitrile/0.045% asidi ya fomu (kimumunyisho B) ilitumiwa kufikia mgawanyiko wa peptidi za tryptic kwa kiwango cha mtiririko wa 300 nL/min: 4% B kwa Dakika 5, kisha 30 kipenyo cha mstari hadi 45% B ndani ya dakika, na ongezeko la mstari hadi 95% kiyeyusho B ndani ya dakika 5.Unganisha safu wima ya kromatografia kwenye nano-emitter ya chuma cha pua (Proxeon), na unyunyuzie kielelezo hicho moja kwa moja kwenye kapilari yenye joto ya spectromita ya wingi ukitumia uwezo wa V 2,300. Uchunguzi wa uchunguzi wenye msongo wa 60,000 katika kichanganuzi kikubwa cha Orbitrap unahusishwa. iliyo na angalau data tatu za uchunguzi wa MS/MS, ambazo hazijajumuishwa kwa sekunde 30, kwa kutumia mgongano wa mitego ya ioni ya mstari au mtengano wa juu wa mgongano wa nishati pamoja na ugunduzi wa orbitrap , Azimio ni 7,500.